Yustinus Prastowo lahir di Gunungkidul, Daerah Istimewa Yogyakarta pada 4 April 1970. Dia merupakan lulusan S1 di Sekolah Tinggi Akuntansi Negara (STAN).
Setelah lulus dari STAN dia melanjutkan pendidikan pasca sarjana dengan mengambil jurusan Ilmu Administrasi dan Kebijakan
Publik di Universitas Indonesia. Dia juga kemudian mengambil gelar Magister Ilmu Filsafat di STF Driyarkara.
Yustinus mengawali karir sebagai pegawai negeri sipil (PNS) di Ditjen Pajak Kementerian Keuangan pada tahun 1997-2010.
Dia juga pernah bekerja sebagai konsultan
sebelum kemudian mendirikan Center for Indonesia Taxation Analysis (CITA) pada tahun 2014.
Yustinus juga merupakan dosen di PKN STAN dan pernah menjadi Senior Adviser
Australia-Indonesia Partnership for Economic Governance (AIPEG) atau yang sekarang bernama Prospera.
Yustinus juga pernah menjadi Consultant Asian Development Bank. Selain itu, dia juga
beberapa kali pernah menjadi ahli perpajakan di Mahkamah Konstitusi, Mahkamah Agung, dan
Ombudsman RI.
Serta pernah menjadi adviser di Tim Reformasi Perpajakan Kemenkeu dan
Anggota Tim Penguatan Reformasi Bea dan Cukai Kementerian Keuangan.